Fleming je rođen na farmi u Lochfieldu blizu Darvela u East Ayrshire, Škotska, a školovan je na akademiji u Kilmanrocku. Poslije je studirao u St. Mary's Hospitalu u Londonu do početka Prvog Svjetskog Rata. Bivši izložen infekcijama umirućih vojnika vratio se u St. Mary's gdje je radio na poboljšanji i otkriće bolje antisepse.

Oba Flemingova otkrića dogodila su se slučajno za vrijeme 1920-ih. Prvo, lisozim otkrio je 1922. nakon što je kihnuo u inficiranu Petri-zdjelicu. Nekoliko dana kasnije otkrio je da je već raspadnuta bakterija počela nestajati.Flemingovi laboratoriji bili su u neredu što mu se pokazalo kao prednost. Kada je 15. rujna 1928. pregledavao laboratorij otkrio je čudnu pojavu. Naravno svaki eksperiment bi pomno pregledao prije bacanja i primjetio je gljivičastu koloniju u jednoj od zdjelica punom bakterije Staphylococcus aureus. Fleming je pomnije proučio koloniju i primjetio da su stanice imale citolizu. Citoliza je dijeljenje stanica, a u ovom slučaju to je bila citoliza potencijalno vrlo štetne bakterije. Važnost je odmah prepoznata, no otkriće je ipak podcijenjeno. Fleming je izdao članak o penicilinu u British Journal of Experimental Pathology1929.